基于籼稻RIL群体的剑叶形态QTL定位

农业人口的不断流失、耕地面积的持续减少、人口总量的快速增加使得世界水稻总产量严重不足，因此，水稻高产相关性状研究仍是目前的热点。有研究表明，水稻产量与其株型密切相关[1]。而作为光合作用的最主要部位，水稻叶片直接参与了机体的光合作用，为水稻的生长发育积累了大量物质与能量，而水稻的剑叶长、剑叶宽性状不但直接决定了水稻叶片的大小，还影响了水稻的株型，进而影响机体的光合效率并在一定程度上决定了水稻的总产量。

水稻剑叶长和剑叶宽的研究始于1983年[2]。1997年，袁隆平提出高产水稻上三叶应具有“长、直、窄、厚”的观点 [3]。水稻剑叶形态不仅对光合效率有影响，而且会影响水稻叶片的蒸腾作用、水稻的抗逆性和水稻的生长发育过程[4]。

随着分子生物学和遗传学相关研究的深入，科学家们成功定位到了许多水稻剑叶形态相关的QTL位点[5]。有研究报道，控制水稻的剑叶长、剑叶宽和剑叶长宽比的位点是由多个基因控制的数量性状座位[6-8]，但是基因定位研究结果存在较大的差异，迄今剑叶相关的基因克隆研究很少。本研究以冈46B和A232为亲本构建高代重组自交系群体,选取178个重组家系(F12)和亲本间有多态性的142对SSR分子标记构建遗传连锁图谱,RIL群体分别种植于湖北武汉和海南陵水,统计两地水稻抽穗期剑叶长度、剑叶宽度和剑叶长宽比，并用QTL IciMapping 4.0软件对其进行QTL定位分析，旨在为后续克隆控制水稻剑叶形态的基因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

籼稻品种冈46B和A232在剑叶形态特征上存在明显的差异，将两者进行杂交得到F1代，然后不断自交，采用单粒传法构建成含有265个家系的RIL群体[9]，并在其中选出178个稳定的家系进行研究。

1.2 遗传连锁图构建和表型鉴定

从265个家系的重组自交系群体中筛选178个表型较为稳定的家系，利用在两亲本中存在多态性的142对SSR(simple sequence repeats)引物对178个家系的基因型进行鉴定与分析，构建遗传连锁图谱[10]。引物较均匀地分布在12条染色体中。

1.3 田间种植

2017年3月，将RIL群体种植于海南陵水英州镇四川省农业科学院南繁基地；2018年5月，将RIL群体种植于湖北武汉华中农业大学试验田。完全随机区组设计，4个重复，每个重复中每个家系种4行，每行5株水稻苗，每相隔18个家系插入2个亲本作为对照。行株距18 cm×25 cm，田间管理同一般大田，专人管理。

1.4 剑叶表型的统计

于抽穗期进行数据的测量和统计，测量178个家系在相同生育期的剑叶表型数据。具体方法为：测量同一片剑叶的叶长和叶宽，并将结果划为一组数据，在各个家系中间的6株水稻上随机均匀取样，每个家系测量12组数据，在距离剑叶根部约8 cm处测量叶片最宽部位作为剑叶宽；测量从叶尖到叶根部的距离作为剑叶长。

1.5 数量性状的鉴定与可行性分析

研究证明剑叶形态相关性状大多符合数量性状特征[11-13]，QTL定位需要研究的目标性状为数量性状，故本研究对剑叶长、剑叶宽和剑叶长宽比进行数量性状分析：根据测量的剑叶表型数据算出均值，并通过Excel做出频数分布图，如果该图呈正态分布，则认为目的性状为数量性状，可以用于后续QTL定位分析。

1.6 QTL定位

利用IciMapping 4.0软件中复合区间作图法对剑叶相关性状进行QTL定位分析[14]，以LOD值2.5为阈值。QTL命名采用McCouch等[15]的方法。根据所得的QTL结果制作表格。

2 结果与分析

2.1 剑叶性状的表型差异性分析

从表1可以看出，亲本品种冈46B的剑叶表型为长宽比较小、宽叶，A232的剑叶表型为长宽比较大、窄叶。RIL群体剑叶长存在超亲现象，海南陵水与湖北武汉3个性状的偏度与峰度基本上小于1。再根据图1结果可知，剑叶长、剑叶宽、剑叶长宽比在两地都符合正态分布特征，且都有一定数量的双向超亲现象，符合数量性状特征:由此证明该群体符合QTL定位分析的基本要求。

2.2 QTL定位分析

利用IciMapping4.0软件对湖北武汉剑叶长、剑叶宽和剑叶长宽比等性状进行QTL定位分析，QTL鉴定 (表2)一共获得了7个QTL位点，其中2个控制剑叶宽度的QTL位点qLW1-1和qLW2,其贡献率分别为11.08%和14.46%;2个位点的加性效应均为负值，都是来自于窄叶亲本A232；控制剑叶长度的3个QTL位点分别为qFLL1-1、qFLL7和qFLL10，其贡献率分别为11.89%、7.28%和21.27%，前2个位点的加性效应均为正值，增效等位基因来自于长叶亲本冈46B，qFLL10的加性效应则为负值，增效等位基因是来自于短叶亲本A232；控制剑叶长宽比的2个QTL位点分别为qFLWR1-1、qFLWR6，其贡献率分别为11.24%和8.14%，qFLWR1-1的加性效应都为负值，增效等位基因来自于A232，qFLWR6的加性效应为正值，增效等位基因则来自于冈46B。

根据海南陵水的QTL结果得到表3，共得到3个剑叶表型性状的7个QTL位点，qFLW1-2、qFLW4和qFLW12为控制剑叶宽的QTL位点，表型贡献率分别为19.60%、11.40%和10.60%，三者的加性效应均为负值，增效等位基因均来源于剑叶表现为窄叶的亲本A232；qFLL1-2、qFLL4和qFLL12为控制剑叶长的QTL位点，贡献率分别为5.56%、7.50%和8.91%，qFLL1-2的加性效应为正值，增效等位基因来源于长剑叶表型的亲本冈46B，而qFLL4和qFLL12的加性效应则为负值，增效等位基因来源于短剑叶亲本A232；qFLWR1-2为控制剑叶长宽比的QTL位点，贡献率为10.42%，qFLWR1-2的加性效应为负值，增效等位基因来自于A232。QTL定位结果显示，在1号染色体上3个剑叶表型性状都检测到了QTL位点，而在其他染色体上未能检测到重复出现于两地的QTL位点，两地在1号染色体上的定位结果重复性较好。

武汉的QTL定位结果中，控制剑叶宽的QTL位点qFLW1-1在RM140与RM493之间，而海南的QTL定位结果中，控制剑叶宽的QTL位点qFLW1-2在RM243与RM3412之间，2个位点相距较近，推测为同一位点，而前人的研究并未在这个区间得到控制叶宽的QTL位点，qFLW2、qFLW4均为首次检测到的控制叶宽的QTL位点，表明qFLW1、qFLW2、qFLW4为本研究新发现的控制剑叶宽度QTL位点。12号染色体上的位点qFLW12与张斌[16]的结果较为接近，推测为同一位点。

武汉关于剑叶长的QTL定位结果显示：qFLL1-1在1号染色体上的位置介于标记RM3362与RM6141之间，而海南的结果qFLL1-2在1号染色体上的位置介于RM6141与RM5310之间，二者相距较近，可以推测为同一位点，此位点与张斌[16]利用超级杂交稻两优培九(培矮64S×93-11)衍生的RIL群体定位到的qFLL1.3和Yan等[17]1999年所定位到的FLL1结果较为一致，可以推测它们是同一位点。其中10号染色体上的qFLL10位点可能和张斌[16]定位的结果为同一个位点。

剑叶长宽比性状的QTL定位结果显示：两地在1号染色体上检测到的2个位点相距较远，推测二者是不同的位点，剑叶长宽比的3个QTL位点与已报道的文献不存在相似的位点，是本研究首次检测的位点。图2为本研究所检测到的QTL位点在各条染色体上的位置分布。

3 讨论

本研究利用窄叶品种A232与宽叶品种冈46B的亲本组合杂交构建的RIL群体F11材料，于2017-2018 年在海南陵水和湖北武汉的不同环境条件下对重组自交系群体中的178个家系开展了剑叶形态相关性状的研究，采用142对在双亲之间表现出多态性的SSR标记引物，运用ICIMapping4.0软件中的复合区间作图法进行QTL分析，结果表明，RIL群体中剑叶形态相关的3个性状在两地均符合连续分布的特性，并且在群体中存在一定的双向超亲遗传现象，说明剑叶长、剑叶宽和剑叶长宽比均符合数量性状的特征，和前人的研究结果一致[18-19]。14个控制剑叶形态相关性状的QTL位点被检测到，这些QTL位点中，解释表型贡献率最高的为21.27%。剑叶长、剑叶宽位点的贡献率在两地均为25%～40%，这是因为多基因间存在相互累加效应。

环境因素极易影响QTL定位的准确性，在本研究中湖北武汉和海南陵水的环境因素差异较大，所得到的QTL定位结果存在着一定的差异。但也有重复性较好的QTL位点，湖北武汉和海南陵水两地均在1号染色体上检测到了剑叶长与剑叶宽的QTL位点，且位点间距离较近，表明1号染色体上控制剑叶长和宽的等位基因基本不受环境因素影响。有研究表明，环境因素在某种程度上会影响同一材料QTL分析结果，而控制不同性状的基因的紧密连锁和基因的多效性会使部分位点在环境因素差异较大的情况下，依然能表现出相同或相似的结果[16]，本研究QTL定位所得到的结果与此类似。同样有报道指出，采用不同亲本组合构建的作图群体所得到的定位结果也会存在差异，推测原因可能为用于作图群体之间的复杂背景遗传差异，如果亲本在某个位点上不存在差异，那么这类QTL位点的定位结果通常会发生能在一个群体被定位到、但在另一个群体中却定位不到的情况 [20]。这说明利用不同群体对相同性状进行QTL定位的结果会存在部分相似，但主要还是会存在较大差异[21]。因此，不同群体在遗传背景上的复杂性对QTL定位的结果有很大的影响。

本研究中水稻剑叶性状相关QTL位点的加性效应大多数表现为负值，少数表现为正值，这表明剑叶表型为窄叶的亲本A232所携带的等位基因对剑叶宽度的遗传起到主导作用，表现为显性效应。

Qi等[22]利用窄叶水稻突变体材料成功克隆了控制水稻剑叶宽的基因Nal1，位于第4号染色体上，其研究结果表明植物激素的合成、传输与剑叶宽的生长发育有关。本研究所检测到的QTL位点多为未报道过的位点，这一结果能够在一定程度上指导后续的基因克隆研究，有一定的应用前景。后续可以在RIL群体中挑选发生超亲现象的窄叶家系与宽叶亲本冈46B连续回交构建回交群体，并在定位区间进一步加密SSR分子标记，理论上可以得到更为精细的位点甚至克隆出相关的等位基因，为培育理想株型的水稻育种工作提供理论依据。

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